Предисловие
Описание
Показания
Учет цвета плазмы
Препараты, которые могут изменить показатели концентрации общего белка
Техника проведения
• Калибровка рефрактометра
• Получение и анализ образца
• Нормальные значения
• Влияние цвета/прозрачности плазмы
Интерпретация уровня белков в плазме/сыворотке кошек и собак
• Введение
• Гипопротеинемия
• Гипоальбуминемия
• Гиперпротеинемия
Дальнейшая диагностика

Предисловие

Белки плазмы – это первичные компоненты крови, которые определяют онкотическое давление плазмы. Белки плазмы делятся на две большие группы – альбумины и глобулины. Почти все белки плазмы производятся печенью, за исключением гамма-глобулинов. Т.е. печень ответственна за производство главных белков плазмы, включая альбумин, белков носителей (пр. трансферрин), белков острой фазы воспаления (пр. С-реактивный белок). Единственным главным белком сыворотки, которые не производится печенью, являются иммуноглобулины, за их продукции отвечают лимфоциты (В-клетки, плазматические клетки). Изменения уровня общего белка развивается либо при изменении объема его продукции, либо при значительных изменениях в потерях.

Измерение общего белка плазмы крови при помощи рефрактометра это скрининговый легко доступный и недорогой тест, который определяет изменения содержания общего белка. Но, для дальнейшей работы зачастую требуются более продвинутые исследования для определения уровня альбумина, глобулин же подсчитывается посредством простого вычитания концентрации альбумина из концентрации общего белка. Альбумин обычно представляет наивысшую концентрацию, составляет приблизительно половину концентрации общего белка. Общий белок лучше интерпретируется совместно с концентрациями альбумина и глобулина сыворотки. Если общий белок плазмы вне референсных интервалов, для определения вероятных причин отклонений, важно получить общий белок сыворотки, концентрации альбумина и глобулина. Соотношение альбумина к глобулину (A:G соотношение) полезно для описания механизма подлежащих изменений содержания общего белка.

Описание

Процедура определения общего белка плазмы или сыворотки основано на способности белка изменять показатель преломления света (refractive index) при изменении его концентрации. Современные рефрактометры калиброваны для определения как удельного веса мочи, так и для определения общего белка плазмы или сыворотки.

Общий белок плазмы при рефрактометрии определяет все плазменные белки цельной крови, включая те, которые вовлечены в процессы свертывания (коагуляцию). Общий белок сыворотки при определении рефрактометром определяет уровень белка в сыворотке после развития процессов формирования сгустка. Общий белок плазмы обычно несколько выше общего белка сыворотки крови, т.к. включает белки коагуляции, которые участвую в формирование сгустка.

Определение общего белка плазмы часто проводится одновременно с определением гематокрита, когда исследуется надосадочная жидкость после центрифугирования у образцов крови с антикоагулянтом (чаще ЭДТА, допустим гепарин). Т.е. во многих ветеринарных клиниках определение общего белка крови входит в состав рутинного исследования под наименованием общий анализ крови (ОАК). Важная часть при определении общего белка плазмы – одновременная оценка цвета и прозрачности плазмы, т.е. данные показатели могут искажать показания уровня общего белка плазмы.

Показания

Определение общего белка плазмы помогает в работе с листом дифференциальных диагнозов при таких состояниях как анемия, гипо/гиперпротеинемия, и протеинурия. Полученные при измерении показатели помогают определить выбор наиболее подходящих дальнейших диагностических тестов.

Концентрация общего белка плазмы может помочь в определении вероятных диагнозов при следующих патологиях: плевральный и абдоминальный выпот; периферические отеки; тонкокишечная диарея; протеинурия; хроническая потеря веса; хронические инфекции; желтуха и бледность слизистых оболочек.

Классическим примером оказанной пользы при измерении общего белка плазма является анемия, развившаяся на фоне кровотечения. При данном состоянии характерно снижение уровня общего белка плазмы, и данные изменения представлены до появления значительного ретикулоцитоза, который указывает на регенеративную анемию. Ретикулоцитоз совместно со снижением количества белка – отличительный признак анемии на фоне кровотечения.

Учет цвета плазмы

При определении общего белка плазмы, должны всегда отмечаться цвет/прозрачность плазмы. Когда цвет и прозрачность не прямо связаны с нарушениями концентрации белка, внешний вид плазмы может быть важен в помощи интерпретации других диагностических тестов.

Так, гемолиз и липемия могут затруднить определение точного содержания общего белка плазмы. Также, ложноположительные результаты при исследовании рефрактометром могут развиваться при тяжелой гипергликемии и азотемии, значительной гипернатриемии и значительной гиперхлоремии. Гипербилирубинемия исторически описывается как причина ложного повышения общего белка сыворотки, но это развивается только при тяжелом повышении билирубина. Сходно, гемолиз влияет на визуальную интерпретацию концентрации общего белка, но не прямо влияет на измерение.

Красная плазма пациента указывает на наличие свободного гемоглобина плазмы, это может поддерживаться внутрисосудистый гемолиз у анемичных пациентов (необходимо наличие гемоглобинурии для подтверждения гемолиза in vivo). Гемолиз скрывает линию интерференции в рефрактометре, что может затруднить точное чтение. Липемия (облачная/белая плазма) может искусственно повысить содержание белка плазмы, т.к. липиды изменяют рефракционный индекс.

Желтушная плазма (желтая) должна повышать подозрение на гипербилирубемию. Данная информация может оказать пользу в определении причин анемии.

Знание характеристик плазмы также помогает интерпретировать биохимические показатели сыворотки, т.к. метод используется для измерения нескольких анализов в химическом профиле может поражаться данными изменениями цвета. Референсная лаборатория должна указывать данные влияющих веществ в их методах.

Препараты, которые могут изменить показатели концентрации общего белка

Гормональные изменения в основном имеют легкий эффект на концентрацию протеина сыворотки, даже если отмечают выраженные физические изменения (пр. масса тела, мышечная масса). У людей гиперпротеинемия может вызываться анаболическими стероидами, прогестероном, инсулином и тироидными гормонами, но сходные эффекты не ожидаются у собак и кошек. Длительная терапия высокими дозами кортикостероидов может вызывать гиперпротеинемию и гиперальбуминемию у нормальных собак, но показатели возвращаются к норме в течение недель после прекращения терапии.

Гипоротеинемия может развиваться по причине воздействий эстрогенов; у людей гипоальбуминемия может развиваться по причине воздействия антиконвульсантов, ацетаминофена, эстрогенов и различные противоопухолевых препаратов. Назначение антиконвульсантов и противоопухолевых препаратов у собак и кошек обычно не вызывает сходные изменения без связанных подлежащих заболеваний (пр. цирроз печени).

Техника проведения

Калибровка рефрактометра

Калибровка должна проверяться ежедневно до начала анализа образца. Призма рефрактометра и крышка протираются бумажным полотенцем, на поверхность призмы наносится капля дистиллированной воды, крышка опускается и дает возможность распространиться воде посредством капиллярного действия.

При взгляде в окуляр обычно отчетливо видны две шкалы – одна для определения удельного веса мочи слева и справа шкала для оценки общего белка плазмы или сыворотки. Расположение шкал может варьировать в зависимости от модели рефрактометра. Шкала удельного веса от 1.000 до 1.050. Линия интерфейса должна быть на показателе 1.000, т.к. удельный вес дистиллята составляет 1.000, для ее смещения используется регулировочный винт сверху прибора.

Калибровка рефрактометра перед проведением исследования является важной частью процедуры и позволяет провести аккуратное получение данных о содержании общего белка в плазме.

 

Фото 1. Внешний вид рефрактометра с поднятой крышкой призмы (китайского производства).

 

Фото 2. Место расположения регулировочного винта (в него упирается отвертка).

 

Фото 3. Вид в окуляр того же рефрактометра, на призму нанесен дистиллят, и линия интерфейса выставлена на ноль посредством воздействия отверткой на регулировочный винт рефрактометра. Слева располагаются две шкалы для определения удельного веса мочи (отдельно для кошек и собак), справа шкала

Получение и анализ образца

Кровь с антикоагулянтом центрифугируется либо в пробирке, либо в микрогематокритных трубках. Исследуется надосадочная жидкость, т.е. плазма, для этого можно пипеткой забрать образец из пробирки, либо сломать микрогематокритную трубку выше элементов крови (при тяжелой дегидратации может потребоваться две трубки).

На призму рефрактометра наносится капля исследуемой плазмы и подняв прибор вверх на свет в окуляре определяется показатель содержания общего белка.

Нормальные значения

Таблица. Нормальные показатели концентрации общего белка и альбумина (г/дл, g/dl)

	Собаки	Кошки
Общий белок плазмы	6.0-7.8	6.0-7.5
Общий белок сыворотки	5.5-7.5	5.5-7.8
Альбумин сыворотки	2.5-4.0	2.5-4.0

Низкие показатели нормальны для очень молодых животных, они постепенно повышаются с возрастом, наивысшие значения в таблица – это средние нормальные показатели зрелых животных. Как альбумин, так и глобулин имеют тенденцию к снижению в пожилом возрасте.
Концентрация глобулинов сыворотки исчисляется отнятием концентрации альбумина сыворотки от концентрации общего белка сыворотки.

Влияние цвета/прозрачности плазмы

При каждом исследовании следует записывать гематокрит и характеристики плазмы. Плазма по своим внешним свойствам определяется как: бесцветная, иктеричная (желтая), красная, белая непрозрачная.

Липемия и гемолиз могут влиять на аккуратность определения общего белка плазмы:
• гемолиз может делать линию интерфейса неразличимой (расплывчатость);
• липемия может искусственно повысить уровень общего белка.

Желтуха не влияет на определения уровня общего белка при помощи рефрактометра.

При длительном хранении, эритроциты становятся хрупкими и могут лизироваться при центрифугировании, что изменяет гематокрит и затрудняет аккуратное определение общего белка плазмы.

Интерпретация уровня белков в плазме/сыворотке кошек и собак

Введение

Концентрация общего белка – прямое отражение кумулятивного уровня альбумина и глобулинов, поэтому изменения только дают подозрение на общие состояния гомеостаза белка. Изменения уровня белка в крови животных могут быть селективными и неслективными. Селективные изменения развиваются при отклонении уровня одного из компонентов общего белка – либо альбумина, либо глобулинов. Неселективные изменения концентрации белка – общее снижение как альбумина, так и глобулинов.

Гипопротеинемия

Гипопротеинемия – снижение концентрации общего белка в плазме ниже референсных значений, может развиваться либо при наружной потере, либо при недостатке производства (в основном печенью). Первое рассмотрение при снижении концентрации общего количества белка обычно состоит в одновременном определении концентрации сывороточного альбумина и глобулинов, т.е. гипопротеинемия подразделяется на селективную и неселективную. При неселективном снижение уровня белка наиболее вероятными причинами будут кровотечения, экссудация с тяжелых кожных поражений, энтеропатия с потерей белка (PLE), и гемодилюция.

Открытое кровотечение должно быть видимым, но желудочно-кишечные потери может быть тяжело определить если они относительно мягкие и хронические. Желудочно-кишечные кровотечения могут развиваться по причине множества типов желудочно-кишечных заболеваний, включая энтеропатию с потерей белка (PLE), но другие неспецифические нарушения, такие как гипоадренокортицизм также должны рассматриваться. Причины энтеропатии с потерей белка множественны. Хотя и альбумин, и глобулин часто снижаются при PLE, в некоторых случаях концентрация глобулина может быть нормальной или повышенной (особенно при других совместных заболеваниях, таких как дирофиляриоз, эрлихиоз, хронические заболевания кожи).

Причины наружной потери белков плазмы могут включать следующие состояния:
• наружное кровотечение;
• заболевания ЖКТ с потерей белка;
– новообразования (чаще лимфома);
– инфекционные заболевания: грибковые (гистоплазмоз, питиоз), вирусные, паразитизм;
– энтеропатия с потерей белка (PLE);
– воспалительные заболевания кишечника (ВЗК, IBD);
– первичная кишечная лимфангиэктазия (редко);
– обструкция кишечника;
• заболевания почек с потерей белка;
– гломерулонефрит (наиболее распространенная причина) часто связан с инфекционными или воспалительными заболеваниями, включая;
–– собаки: воспалительные неинфекционные (хронические воспалительные заболевания ЖКТ, хронические иммунно-опосредованные заболевания, хронические заболевания зубов); воспалительные инфекционные (рикетсиальные, дирофиляриоз, хронические бактериальные заболевания);
–– кошки: воспалительные неинфекционные (относительно редкая причина); инфекционные (ВЛК, ВИК, вирус инфекционного перитонита);
– почечный амилоидоз (относительно редок);
–– связанный с породой или семейный (Абиссинская порода кошек, Шар-пей);
–– системный реактивный амилоидоз (хронические воспалительные заболевания);
• тяжелые кожные заболевания с экссудацией плазмы.

Важно интерпретировать концентрацию общего белка в контексте концентрации альбумина и глобулина, так при кровотечении и желудочно-кишечных потерях снижаются концентрации как альбуминов, так и глобулинов. Но, при почечных потерях, где потеря белка более выборочна, альбумин определяется как первичная потеря белка. Важно также проводить интерпретацию гипопротеинемии совместно с данными содержания белка в моче, при его отсутствии, почечная гематурия может быть исключена.

Причины снижения продукции белка включают в себя следующие:
• снижение продукции белка печенью (снижается уровень альбумина и не-иммуноглобулиновых белков);
– хроническое заболевание печени на последней стадии;
– порто-системные шунты;
– голод (для снижения белка требуются недели исключительного голода, при этом более характерна гипоальбуминемия);
• снижение продукции иммуноглобулинов;
– наследственные дефициты;
– неадекватное потребление молозива новорожденными.

Гипоальбуминемия

Гипоальбуминемия при гипопротеинемии имеет наибольшее клиническое значение, и поэтому в данной статье рассматривается отдельно.

Блок. Причины гипоальбуминемии у собак и кошек

Сниженная продукция
Хроническая печеночная недостаточность^*,1.
Неадекватное потребление протеина^†,‡.
Нарушения пищеварения (maldigestion) ^†.
Нарушения всасывания (malabsorption) ^†.

Гипергаммаглобулинемия
Секвестрация
– выпот в полости тела
– васкулопатия
Повышенные потери
– нефропатия с потерей белка (PLN) по причине клубочковых поражений^*,1.
– желудочно-кишечные: энтеропатия с потерей белка (PLE)^*,2.
– экссудация с кожных поражений².
– кровотечения².
Гемодилюция².

* Наиболее частая и важная причина снижения уровня сывороточного альбумина ≤2.0 g/dl. Другие причины крайне редко вызывают снижение уровня сывороточного альбумина ≤2.0 g/dl.
† Сомнительная важность в роли единственной причины снижения сывороточного альбумина ≤2.0 g/dl.
Возможно более важен как способствующий фактор других проблем ведущих к гипоальбуминемии.
‡ Может быть важной причиной у очень молодых животных или животных с кормлением крайне ограниченной по белку диетой в течение длительного времени.
1. Важная селективная причина
2. Важная неселективная причина
Замечание: Нефропатия с потерей белка (PLN) крайней выраженности иногда вызывают сопутствующую гипоглобулинемию.

Гемодилюция редко вызывает гипоальбуминемию, но она может развиться по причине перегрузки внутривенными жидкости или плазмозаменителей (пр. ГЭК), заболеваний, вызывающих отек (пр. ЗСН), и редко от избытка антидуретического гормона (АДГ, ADH). Гемодилюция обычно вызывает мягкое снижение (альбумин 2.1-2.4 g/dl), тогда как энтеропатия с потерей белка (PLE) может вызывать выраженную (1.5- 2.0 g/dl) и тяжелую (<1.5 g/dl) гипоальбуминемию.

Снижения количества альбумина совместно с нормальным или повышенным уровнем глобулина может описываться как селективная гипоальбуминемия.

Наиболее частая и клинически значимая причина снижения производства альбумина – хроническая печеночная недостаточность, повышение потерь при нефропатии с потерей белка (PLN), или секвестрация в полость тела по причине развития значительных выпотов. Хроническая недостаточность работы печени может вести к выраженной гипоальбуминемии (<1.0 g/dl) при тяжелой форме поражения. Причины недостаточности работы печени могут быть множественными и могут быть врожденными (пр. врожденный портокавальный шунт) или приобретенными (пр. цирроз, новообразования).

Гипоальбуминемия при нефропатии с потерей белка (PLN) может быть значительной (пр. <2.0 g/dl, даже <1.5 g/dl). При обнаружении потери белка с почками, анализ мочи ± соотношение протеина:креатинина в моче обычно показаны для подтверждения наличия и тяжести альбуминурии.

Секвестрация альбумина может развиться в полости тела (грудную, брюшную) или подкожные ткани. Пациенты с выпотом, вызываемым гипоальбуминемией могут далее снижать уровень сывороточного альбумина через секвестрацию. Альтернативно, секвестрация может быть вторичной к повышению гидростатического давления (пр. портальная гипертензия, правосторонняя ЗСН). Иммунно-опосредованные или инфекционные васкулопатии (пр. эндотоксемия и бактериемия, эрлихиоз, пятнистая лихорадка скалистых гор) также позволяют развиться потери альбумина из сосудистого компартмента. Гипоальбуминемия как результат секвестрации или васкулопатии обычно мягкая.

Тяжелое нарушение питания, нарушения переваривания или абсорбции ведет к плохому поступлению белка и это может быть связано с гипоальбуминемией, но в основном данное состояние вызывает очень мягкую гипоальбуминемию.

Сходно, гиперглобулинемия по причине воспаления может вызывать мягкую гипоальбуминемию по причине понижающей регуляции (down-regulation) продукции альбумина для возмещения повышения уровня глобулина, или по причине того, что альбумин является белком отрицательной острой фазы, который снижается при воспалении.

Значительная гипоальбуминемия (пр. альбумин < 2.1 g/dl) не должна быть связана только со сниженным питанием или сниженной регуляции продукции альбумина, пока не исключены нарушения с потерей белка посредством окончательных тестов (не только история и физикальное обследование), т.к. голод и сниженная регуляция редко вызывают снижения концентрации альбумина менее 2.1 g/dl, за исключением очень молодых животных.

При подозрении на недостаточность работы печени, исследуются сывороточные желчные кислоты и аммоний крови. При наличии протеинурии без пиурии или гематурии совместно с гипоаульбминемии, должно исследоваться соотношение белок:креатинин мочи. Пиурия и гематурия может вызывать протеинурию, делая невозможным определения клубочковых потерь; поэтому показан последующий анализ мочи проводится после разрешения пиурии или гематурии.

Должны проводиться попытки разделить степень гипоальбуминемии на мягкую (2.1-2.4 g/dl), умеренную (1.5-2.0 g/dl) и тяжелую (<1.5 g/dl) в порядке установки начальных дифференциальных диагнозов. Однако, окончательное исключение потенциальных причин не должно проводиться до дополнительного тестирования, т.к. мягкая гипоальбуминемия может наблюдаться в некоторых случаях нефропатии или энтеропатии с потерей белка (PLE и PLN) и на ранних стадиях печеночной недостаточности.

Начальный подход пациентов с гипоальбуминемии начинается с клинической оценки. Тяжелые кожные экссудативные поражения могут диагностироваться посредством физикального обследования, но вероятности заболеваний почек, печения и пищеварительного требуют расследования. Подкожные отеки и выпоты в полости тела связанные с гипоальбуминемией обычно являются транссудатом. Гипоальбуминемия связанная с PLN или PLE, хронической недостаточности печени, и иммунно-опосредованными или инфекционными васкулитами могут вызывать выпот в полости, первично транссудат. Однако, должно всегда оцениваться скопление жидкости для уверенности что они по факту транссудат в противоположность неожидаемого модифицированного транссудата или экссудата (что строго предполагает, что более чем гипоальбуминемия вызывает выпот).

Следующее, распознание некоторых паттернов диагностических образцов может быть характерно для различных болезненных процессов.

Гиперхолестеролемия плюс гипоальбуминемя предполагает нефропатию с потерей белка (PLN). Значительная протеинурия без пиурии и гематурии указывает на диагностическую работу для PLN. Гипохолестеролемия плюс гипохолестеролемия плюс гипоальбуминемия характерна для печеночной недостаточности или энтеропатии с потерей белка (PLE). Гипоальбуминемия связанная с гепатомегалией; микрогепатией; неврологическими признаками; желтухой; снижением азота мочевины крови (BUN) совместно или без повышения АЛТ, ЩФ (или обоих), или отклонения результатов печеночных тестов (пр. желчные кислоты сыворотки) указывают на необходимость диагностической работы на предмет печеночной недостаточности.

Замечание: АЛТ и ЩФ могут быть нормальными у многих пациентов с тяжелом печеночной недостаточностью, у собак с врожденными портокавальными шунтами может отмечаться сниженные средний объем эритроцита (MCV).

Врожденный порто-системные шунты наиболее вероятны у молодых животных; однако, врожденные шунты могут диагностироваться в возрасте более 10 лет. Приобретенные заболевания печени более характерны у взрослых животных, и требуют для диагностики биопсии печени; однако, некоторые собаки в возрасте менее 1 года имеют тяжелые, приобретенные заболевания печени с приобретенными шунтами.

Гипоальбуминемия с нормальными тестами функции печени и отсутствия протеинурии или кожных поражений позволяют диагностировать энтеропатию с потерей белка (PLE) методом исключения, даже если фекалии нормальные.

Если пациенты имеют болезни печени и почек и все-таки рассматривается PLE, измерения концентрации ингибитора альфа1-проетазы в фекалиях может позволить диагностировать PLE методом исключения. Кишечная биопсия может далее обеспечить окончательный диагноз заболевания кишечника вызывающую энтеропатию с потерей белка. Эндоскопическая биопсия безопаснее чем хирургическая, но критично получить тканевые образцы отличного качества и при эндоскопическом заборе качество образцов чаще страдает. При проведении диагностической лапаротомии, биопсия печения должна быть проведена совместно с кишечной биопсией. Важно получить образцы биопсии из нескольких мест на протяжении тонкого кишечника, даже если не обнаружены макро-поражения.

Гиперпротеинемия

Гиперпротеинемия – повышение концентрации общего белка выше референсных интервалов, чаще всего вызывается дегидратацией или хроническим воспалением. Однако, лимфоидные новообразования (пр. миелома) могут вести к гиперпротеинемии по причине продукции моноклональных иммуноглобулинов, что умеренно или выраженно повышает глобулиновую часть белка сыворотки. Единственная значимая причина гиперальбуминемии – дегидратация.

Причины гиперпротеинемии включают в себя следующие:
• дегидратация (повышается уровень как альбуминов так, и глобулинов);
• воспаление: снижается уровень альбумина (реагент обратной фазы) и повышается уровень глобулинов (воспалительные протеины и иммуноглобулины);
• моноклональная гаммопатия (повышается продукция одного типа иммунноглобулина при помощи неопластических лимфоидных клеток (обычно плазмациты)).

При оценке общего белка для грамотного подхода важен статус гидратации животного. При клинической дегидратации, должно отмечаться повышение общего белка. Если клинически обезвоженный пациент имеет нормальный уровень общего белка, то его уровень может понижать ниже референсных значений при возмещении дефицита жидкостей. Если обезвоженный пациент имеет низкую концентрацию общего белка, должен учитываться при инфузионной терапии эффект регидратации на дальнейшее понижение общего белка (и следовательно, онкотическое давление).

Дальнейшая диагностика

При аномальных показателях общего белка плазмы необходимо проводить полное биохимическое исследование:
• Общий белок плазмы и альбумин – как отмечено ранее, это необходимо для полной оценки уровня белка пациента и определения причин изменений уровня общего белка (т.е. общий белок, альбумин, глобулины).
• АЛТ, ЩФ, билирубин, глюкоза, азоте мочевины крови (BUN), холестерол – должна проводиться оценка аналитов биохимического профиля для выявления дисфункции печени.
• Азот мочевины крови (BUN), электролиты, холестерол – должны оценивать состояние почек при значительной потере белка.

Анализ мочи необходим для идентификации почечных потерь белка.

Сывороточный электрофорез белков – важное средство в определении причин значительного повышения глобулинов. Тесты референсной лаборатории с использованием электрофореза используют отделение белков по заряду и размеру. Электрофорез белков сыворотки может дифференцировать между повышением глобулинов по причине воспаления, поликлональную экспансию имммуноглобулинов (поликлональная гаммопатия) от повышения по причине новообразования, моноклональной экспансии иммуноглобулинов (моноклональная гаммопатия). Большинство моноклональных гаммопатий развиваются по причине лимфоидных новообразований. Однако, существует несколько инфекционных агентов, которые могут быть связаны с моноклональной гаммопатией (Ehrlichia spp. у собак и инфекционный перитонит у кошек).